奥林巴斯荧光显微镜错误

荧光照射条件下的显微照相呈现出一组*特的环境，为显微镜专家带来了特殊问题。曝光时间通常非常长（在某些情况下从几秒钟到几分钟），样品的荧光在曝光期间可能会褪色，而完全黑色的背景通常会无意中发出光度计信号，表明过度曝光。

另外，荧光标本发射它们自己的光，并且位于所需焦平面上方和下方的粒子经常辐射光，导致图像细节模糊。尽管通过显微镜目镜观察时荧光图像可能看起来很亮（由于人眼对光线的敏感性），但为了在胶片上记录令人满意的图像，它们通常需要较长的曝光时间。非常长的曝光使得用荧光染料染色的样本的显微照相复杂化，增加了振动的可能性和膜互易失效效应，导致图像中不希望的色移。

虽然荧光显微照相的基本问题通常是光线到达胶片的缺乏，但是可以采取许多步骤来改善图像质量。用于荧光的显微镜物镜应具有尽可能高的数值孔径，在实验中使用光波长的高透射率值。因为光强度（反射光荧光）随数值孔径的四次方变化，所以这些物镜可以显着减少反射光荧光显微镜中的曝光时间。光强度也与放大倍数的平方成反比变化，当胶片上的总放大率保持较小时，导致更亮的图像。通常使用低放大率光学镜（或投影镜头）来辅助降低胶片平面上的放大率。此外，当使用三目头时，通常希望将所有光转向摄像机，而不是在观察目镜和摄像机之间进行光分离（通过分束器）。因为图像强度也与到胶片平面的距离的平方成反比地变化，所以显微镜表现得更好，然后该距离保持很短。出于这个原因，并且由于广泛的可用性，当使用传统的显微摄影术捕获图像时，大多数荧光显微镜记录在35毫米胶片上（而不是更大的格式）。

低光照水平和荧光标本的褪色是荧光显微照相术中要克服的两个主要困难。通常，荧光制剂的动态性质使得良好的显微摄影术对于捕获与样本发生的事件的记录是必要的，并且通常可以在通过目镜检查样本时揭示不明显的细节。长时间曝光，如此常用于荧光，不可避免地导致在长时间照射期间的互易失效和样本荧光强度的褪色。实际上，特定荧光特征的衰落通常比背景的快，导致图像对比度的损失。

所有照相乳剂（包括黑色和白色，彩色负片和彩色透明膜）在暴露于光下**过长时间或短时间时都会受到称为互易律失效的影响。互易律将图像密度与曝光时间和光强度联系起来，使得显微镜中的照明强度与胶片所需的曝光时间之间存在相互关系。实际上，该法律规定曝光时间与光强度成反比，以保持恒定的胶片密度。光强度越低，产生令人满意的图像所需的曝光时间越长。如果适当的曝光持续时间在1/500秒和1/2秒之间，则这种反比关系适用于大多数胶片。

在荧光显微镜中，低光照水平通常需要**过1/2秒的曝光（通常在几秒到几分钟的范围内）。在这些条件下，互易关系不再成立，并且胶片将需要额外的曝光时间以产生适当的图像密度。这种现象称为互易失效，该术语仅表示曝光时间和光强度之间的线性关系不再成立，并且不表示薄膜乳液在性能方面的失效。

互易律失效的副作用是通过样品的光漂白进一步降低已经很弱的样品荧光，并且由于曝光时间增加经常发生不正确的颜色再现。图2中呈现的一系列图像是荧光显微照片，其示出了当使用Olympus WIB长通荧光立方体成像时用流行的荧光素-5-异硫氰酸酯（FITC）标记的抗体荧光染料。使用针对互易律失效校正的校正曝光时间和Kodak Wratten颜色补偿滤光器拍摄中心的单元（图2（b）），以消除不希望的色移。在左侧（图2（a）），相同的视野显示了由于长时间暴露于照射源而导致的光漂白或荧光活性的褪色的影响。

通常可以通过增加曝光时间或黑白胶片的加工条件来补偿互易失效，但对于彩色负片和透明胶片来说并非总是如此。大多数彩色胶片具有三个颜色敏感的染料层，每个颜色敏感的染料层具有略微不同的特征曲线位置和斜率，导致对互易效应的变化响应，可能引起不希望的颜色偏移或铸造。通常，在使用彩色胶片时，必须调整曝光时间和色彩平衡滤光片以补偿非常长或短的曝光。

利用具有非常小的数值孔径的物镜（例如，具有NA = 0.65的40x物镜而不是具有0.85,0.95或1.0的NA的相同放大物镜）产生显示亮度不足的图像，这导致更长的时间曝光时间。数值孔径是物镜聚光能力的量度，意味着高数值孔径物镜可以捕获更大量的发色团产生的弱荧光发射。在进行荧光显微照相时，始终使用较高可用的物镜数值孔径。使用过多的物镜和光电目镜放大也会导致亮度降低。为了弥补这一点，在给定的放大倍数下，始终采用尽可能低的放大率光学物镜和较高数值孔径物镜。例如，数值孔径为0.95（亮度指数= 22.6）的60x平面复消色差物镜优于数值孔径等于0.85（亮度指数= 14.5）的60x平面萤石物镜，即使萤石物镜的工作距离为复消色差的两倍。此外，由于高数值孔径物镜具有较浅的景深，因此它们的使用可以避免从焦平面上方或下方的离焦发射的对比度降低效应。同样，2.5x光镜将提供比3.3x或5x目镜更多的照明。